¿Qué es la secuencia de escopeta?
La secuencia de escopeta es un método de secuenciación de ADN mediante el cual un largo tramo de ADN se divide físicamente en pequeños fragmentos (aproximadamente 2,000 pares de bases) que se clonan, secuencian y ensamblan mediante análisis por computadora. Fue desarrollado y hecho famoso por Craig Venter de Celera Corporation. Venter desarrolló la técnica en 1996 mientras trabajaba en el Instituto de Investigación del Genoma.
Venter fundó Celera en 1998 con la misión de secuenciar el genoma humano en tres años. Este objetivo estaba en competencia directa con el Proyecto del Genoma Humano, que ya está en funcionamiento, un consorcio de universidades que trabajan juntas para secuenciar el genoma humano utilizando una estrategia más antigua llamada secuenciación basada en mapas o BAC a BAC. Este método implicaba primero dividir el genoma en 150,000 piezas de pares de bases llamadas BAC, ensamblar los BAC en orden y luego secuenciar cada BAC en detalle.
La secuenciación de la escopeta del genoma completo evita la creación y el mapeo de BAC y comienza directamente con la secuenciación del ADN. El proceso comienza con la adquisición de una muestra de ADN de alto peso molecular del organismo de interés y físicamente rompiéndolo en pedazos pequeños pasándolo a través de una jeringa de calibre estrecho o sonicándolo, una forma de romper la muestra usando ondas de sonido. El corte es un proceso aleatorio, por lo que las secuencias de los fragmentos tendrán cierta superposición entre ellos. El corte no crea específicamente los fragmentos de 2,000 pares de bases necesarios para la secuenciación, sino que los fragmentos del tamaño deseado deben purificarse de la mezcla.
El siguiente paso es unir los fragmentos de ADN con el ADN portador llamado vector. Este proceso se conoce como clonación y crea una biblioteca de secuenciación a partir de la cual se creará la secuencia de un genoma completo. Se determina la secuencia de cada clon en la biblioteca, y el análisis por computadora se usa para encontrar secuencias superpuestas o continuas en cada fragmento. El ensamblaje de las superposiciones crea un "contig", que es un largo tramo continuo de secuencia de ADN.
La clonación de escopeta generalmente generará algunos espacios entre contigs porque algunas secuencias faltan de la biblioteca por casualidad. Los huecos se pueden llenar creando una nueva biblioteca o utilizando secuencias conocidas para extenderse hacia afuera desde el contig. Debido a que la secuencia de la escopeta secuencia los fragmentos de ADN al azar, muchos fragmentos se secuencian más de una vez, creando una mayor certeza de que la secuencia es correcta que si cada fragmento solo se hubiera secuenciado una o dos veces.
El genoma humano fue secuenciado tanto por el Proyecto del Genoma Humano usando secuenciación basada en mapas como por Celera usando secuenciación de escopeta. La secuencia de escopeta es ahora el método preferido para otros tipos de secuenciación del genoma. Los genomas completos de muchos organismos, como la planta Arabidopsis thaliana , el arroz, la vaca, el perro, el pollo, el chimpancé, la rata, el ratón, el pez globo y muchos microorganismos se han secuenciado de esta manera.